熒光染色是個(gè)麻煩的工作流程，辛苦染色樣品就為了獲得一張好的熒光圖片，如果成像沒(méi)做好、圖片沒(méi)拍好，那真的是血虧、白忙活。為什么要用熒光成像？如何用熒光顯微鏡拍攝才能獲得高質(zhì)量的熒光成像？今天我們就來(lái)給大家介紹一下。

1、熒光成像：現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室是不可少的技術(shù)

熒光染色工作流相對(duì)明場(chǎng)染色復(fù)雜，那為什么要用熒光成像呢？首先回歸基礎(chǔ)概念，熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，指某些物質(zhì)（如熒光探針）在一定波長(zhǎng)激發(fā)光的照射下，在短時(shí)間內(nèi)發(fā)出比激發(fā)光波長(zhǎng)更長(zhǎng)、能量更低可見(jiàn)光的現(xiàn)象。

熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)勢(shì)，熒光探針可以特定性標(biāo)記細(xì)胞器等目標(biāo)，非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，離子濃度變化等生命動(dòng)態(tài)過(guò)程的追蹤等等，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域，是現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室標(biāo)配的檢測(cè)方案、成像方案。

熒光成像一般使用熒光顯微鏡進(jìn)行，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，需要選擇不同型態(tài)的熒光顯微鏡，比如切片類(lèi)樣品或水質(zhì)檢查等高倍觀察適合用正置熒光顯微鏡，培養(yǎng)皿、活細(xì)胞類(lèi)樣品適合用倒置熒光顯微鏡，植物和模式生物等大樣品適合用體視熒光顯微鏡。

2、熒光顯微鏡的兩個(gè)核心部件

熒光的產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)過(guò)程，在熒光顯微鏡中具體體現(xiàn)為熒光光源和激發(fā)塊兩個(gè)關(guān)鍵部件，已經(jīng)都整個(gè)在熒光臂（熒光模塊）中，沒(méi)有這兩個(gè)部件，熒光無(wú)從談起，這兩個(gè)部件不合適，熒光效果大打折扣。

（1）激發(fā)光源：主要包含以下兩個(gè)指標(biāo)

光源光譜覆蓋發(fā)射光譜：熒光探針在特定波段范圍才能被激發(fā)，因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光探針的激發(fā)特征。

發(fā)射光譜波段的強(qiáng)度：熒光信號(hào)一般較弱，需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強(qiáng)信號(hào)的發(fā)射熒光信號(hào)。

（2）激發(fā)塊：用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片，一般包含以下三個(gè)

激發(fā)濾光片EX：濾過(guò)光源中特定波段的光，用以激發(fā)樣本中特定熒光探針

發(fā)射濾光片EM：允許熒光探針發(fā)射的特定波段的光通過(guò)

二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過(guò)發(fā)射波段的光。

3、成像“寧欠勿曝"是個(gè)坑，曝光盡量亮一點(diǎn)

看完上面的資料，大家應(yīng)該都對(duì)熒光顯微鏡有更好的了解了，下面我們來(lái)講成像拍照部分。

現(xiàn)在的熒光成像拍照基本都是用熒光顯微鏡搭配顯微鏡數(shù)字相機(jī)進(jìn)行的，但不少教學(xué)資料可能還停留在膠片時(shí)代，這些資料可能和數(shù)字相機(jī)不太對(duì)得上，典型的就是“寧可欠曝，也不要過(guò)曝"，簡(jiǎn)稱(chēng)“寧欠勿曝"。舉個(gè)例子，上圖是一張JPG格式的欠曝的斑馬魚(yú)熒光圖片，看起來(lái)有點(diǎn)費(fèi)眼神。

通過(guò)后期調(diào)整亮度，斑馬魚(yú)的信號(hào)是增強(qiáng)了，但背景的雜訊和噪點(diǎn)也增強(qiáng)了，看起來(lái)很不干凈，色彩也出現(xiàn)了斷層。

膠片相機(jī)擅長(zhǎng)表現(xiàn)暗部，因此才有“寧欠勿曝"，而顯微鏡數(shù)字相機(jī)相反，不擅長(zhǎng)表現(xiàn)暗部，如果圖片欠曝，那么有效信號(hào)就更可能跟背景噪聲混在一起，從而降低了圖片的信噪比，成像效果就會(huì)不理想。因此對(duì)于顯微鏡數(shù)字相機(jī)來(lái)說(shuō)，樣品信號(hào)的曝光盡量亮一點(diǎn)會(huì)更好，這可以通過(guò)在明美顯微成像系統(tǒng)中增加曝光時(shí)間或增益實(shí)現(xiàn)。

4、選擇合適的熒光光源和激發(fā)塊

提升信號(hào)亮度

上面我們介紹過(guò)，熒光顯微鏡有兩個(gè)核心部件，熒光光源和激發(fā)塊。要提升熒光亮度，除了調(diào)整相機(jī)的曝光時(shí)間和增益，還要選擇高光強(qiáng)的熒光光源和合適的濾光片組。熒光光源典型代表是高壓汞燈，它可以在特定波長(zhǎng)提供非常高的光強(qiáng)，缺點(diǎn)是需要預(yù)熱，使用壽命較短，且在壽命用盡之前還會(huì)有亮度衰減問(wèn)題，如果你的汞燈亮度不足，建議先看看ND濾鏡是不是調(diào)錯(cuò)了，如果ND濾鏡沒(méi)錯(cuò)，那可能就是壽命快到了，要換個(gè)燈泡或換掉整個(gè)熒光光源。

部分資料可能還將金屬鹵素?zé)袅袨闊晒夤庠矗m然鹵素?zé)裟芨采w激發(fā)光譜，且使用壽命比汞燈更長(zhǎng)，但用作熒光光源時(shí)光強(qiáng)是不足的，熒光信號(hào)弱，不適合用于數(shù)字成像。

現(xiàn)在我們有比汞燈和鹵素?zé)舳家玫臒晒夤庠?，LED熒光光源，比如寬光譜大功率LED熒光光源和四通道光源. LED熒光光源能提供接近汞燈的激發(fā)光譜和光強(qiáng)，而且可以即開(kāi)即用，亮度可以線性調(diào)整，省去了預(yù)熱、調(diào)ND濾鏡等一系列流程，使用更加方便，而且壽命還能達(dá)到汞燈等幾十倍甚至上百倍。

激發(fā)塊用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射光譜，如果激發(fā)塊的參數(shù)和熒光探針的參數(shù)不匹配，就會(huì)導(dǎo)致樣品熒光信號(hào)弱，需要切換到合適的激發(fā)塊解決。另外激發(fā)塊還有個(gè)通光效率的參數(shù)，一般進(jìn)口濾光片組的通光效率要比國(guó)產(chǎn)濾光片組好幾十個(gè)百分比，熒光信號(hào)顯著更強(qiáng)，背景更暗，信噪比更高，但對(duì)應(yīng)地成本也會(huì)高很多，明美選用進(jìn)口濾光片組裝熒光激發(fā)塊，在保障良好的激發(fā)效果前提下，有效降低了成本，并且除了BGUYR等常用波段，還有針對(duì)結(jié)核檢查的寶藍(lán)B2和針對(duì)熒光原位雜交FISH的藍(lán)綠雙通等特殊配置，大大提升了病理檢查等成像應(yīng)用的效率。

5、使用高靈敏度相機(jī)和色階/曲線

提升信噪比

數(shù)字相機(jī)隨著增益值提升和曝光時(shí)間的增加，會(huì)有不同程度的背景噪聲和熱噪聲問(wèn)題，使用高靈敏度相機(jī)可以用更低的曝光時(shí)間實(shí)現(xiàn)理想的曝光，這不僅更方便拍攝未固定的樣品，還能帶來(lái)更高的信噪比，因此熒光成像一般推薦用高靈敏度相機(jī)。

熒光成像通常多多少少會(huì)有背景熒光問(wèn)題，使用熒光擋板遮擋明場(chǎng)聚光鏡，能減少落射熒光成像時(shí)的背景熒光，而在數(shù)字相機(jī)成像時(shí)，我們可以通過(guò)調(diào)整明美顯微成像系統(tǒng)的色階或者曲線設(shè)置，實(shí)時(shí)壓低或去除背景熒光信號(hào)，再拍照。比如色階處理中，我們通常把滑條左下的滑塊往右調(diào)，來(lái)去除背景熒光信號(hào)，然后將中間滑塊往左調(diào)，適當(dāng)補(bǔ)償樣品信號(hào)，即可獲得高信噪比的成像。

6、圖片格式用TIFF更保險(xiǎn)

在一開(kāi)始的例子中，我們特別強(qiáng)調(diào)了JPG格式，那是不是用其他格式會(huì)更好？還真的是。

通過(guò)簡(jiǎn)單后期處理，我們還是可以獲得一張能用的樣品圖。這是因?yàn)镴PG文件格式會(huì)將暗部細(xì)節(jié)和高光細(xì)節(jié)等人眼不善于分辨的內(nèi)容丟掉，來(lái)壓縮數(shù)據(jù)量，這里面可能就包含對(duì)我們有用的樣品細(xì)節(jié)，而TIF格式可以?xún)?chǔ)存未壓縮的原始數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)處理還是有機(jī)會(huì)用得上的，這也是論文圖片通常用TIF格式的原因。