在計(jì)算分辨率的理論J限的時(shí)候需要考慮很多因素。分辨率還取決于樣本性質(zhì)。我們來(lái)看一下使用阿貝衍射J限以及使用瑞利判據(jù)進(jìn)行的分辨率計(jì)算。

先應(yīng)當(dāng)要牢記：

NA= n x sin α

式中n為成像介質(zhì)的折射率，α是物鏡孔徑角的一半。物鏡的Z大孔徑角大約為144o。該角度一半的正弦為0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為1.52，則物鏡的Z大NA為1.45。如果使用‘干式’（無(wú)浸沒(méi)）物鏡，則物鏡Z大NA為0.95（因?yàn)榭諝獾恼凵渎蕿?.0）。

橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為：

d= λ/2 NA

式中λ 是標(biāo)本成像所用的光波長(zhǎng)。如果使用514 nm的綠光及NA為1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）J限將達(dá)到177 nm。

軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為：

d= 2 λ/NA2

同樣的，如果我們假設(shè)通過(guò)波長(zhǎng)514 nm的光來(lái)觀察標(biāo)本且物鏡NA數(shù)值為1.45，則軸向分辨率為488 nm。

在阿貝衍射J限的基礎(chǔ)上，瑞利判據(jù)稍稍得到了細(xì)化：

R= 1.22 λ/NAobj+NAcond

式中λ為標(biāo)本成像用的光波長(zhǎng)。NAobj 為物鏡NA。NAcond為聚光鏡NA?！?.22’是一個(gè)常系數(shù)。該數(shù)值根據(jù)Rayleigh的貝塞爾函數(shù)研究推導(dǎo)得出。這些主要用于對(duì)系統(tǒng)當(dāng)中的問(wèn)題，例如波的傳遞，進(jìn)行計(jì)算。

將聚光鏡的NA考慮在內(nèi)，空氣（折射率為1.0）通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質(zhì)。假設(shè)聚光鏡的孔徑角為144o，則NAcond數(shù)值將等于0.95。

如果使用514 nm的綠光，油浸物鏡的NA為1.45，聚光鏡的NA為0.95，則分辨率的（理論）J限將達(dá)到261 nm。

如上所述，用于對(duì)標(biāo)本成像的光波長(zhǎng)越短，可以分辨的細(xì)節(jié)越多。因此如果使用400 nm的Z短可見(jiàn)光波長(zhǎng)，油浸物鏡NA為1.45，聚光鏡NA為0.95，則R等于203 nm。

要在顯微鏡系統(tǒng)當(dāng)中達(dá)到（理論）分辨率的Z大值，每個(gè)光學(xué)組件都應(yīng)當(dāng)具備Z高可用的NA（把孔徑角納入考慮）。此外，觀察標(biāo)本所用的光波長(zhǎng)越短則分辨率越高。Z后，整個(gè)顯微鏡系統(tǒng)都應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)直對(duì)齊。